آماده سازی لامهای نانوذرات فلورسنتی برای تعیین وضوح میکروسکوپ از اهمیت بالایی برخوردار است زیرا ایجاد هرگونه اشتباهی در هر یک از مراحل آماده سازی نمونه ها و دور شدن از آماده سازی دقیق و ایده آل منجر به خطا و انحراف در اندازه گیری تابع گسترش نقطه و تعیین اشتباه وضوح اجزای نوری میکروسکوپ و در نتیجه وضوح خود میکروسکوپ می شود.
کاربرد نانوذرات فلورسنتی با توجه به میزان دشواری آماده سازی آنها، محدوده آشکارسازی، تمایل خوشه ای شدن نانوذرات و فلورسانس پس زمینه، محدود می شود. تعدادی از این نانوذرات فلورسانس برای غلبه بر این مشکلات طراحی شده اند مانند رودامین، فلورسین، نیل قرمز و چند مورد دیگر اغلب برای آماده سازی کره های فلورسنتی مورد استفاده قرار می گیرند. از میان آن ها رودامین و فلورسین از زیست سازگاری خوبی برخوردار هستند، بازده کوانتومی بالا و ضریب خاموشی بالایی دارند.
اغلب نانوذراتی که برای کالیبراسیون میکروسکوپ ها در بازار به صورت تجاری عرضه می شوند به صورت محلول سوسپانسیون در غلظت های مشخص هستند، مانند میکروسفرهای شرکت معروف Thermo Fisher.
مراحل آماده سازی لام نانوذرات فلورسنتی
1- با توجه به غلظت مورد نیاز نانوذرات در محلول، آنها را باید با آب مقطر پزشکی رقیق کرده تا محلول نانوذرات به درجه رقیق سازی مورد نظر برسد. عموما برای اندازه گیری تابع گسترش نقطه و تعیین وضوح میکروسکوپ از محلول نانو ذرات 2% جرمی یا کمتر استفاده میشود.
نکته: این درصد رقت مخصوص نانو ذره 100 نانومتری است و برای سایر نانوذرات فلورسانس ممکن است درصد رقیق سازی دیگری مورد نیاز باشد.
2- لازم است محلول 2% جرمی را به منظور جداسازی نانو ذرات به هم چسبیده و اطمینان از عدم حضور نانوذرات خوشه ای در آماده سازی لام با توجه به نوع و جنس نانوذرات مورد استفاده در زمان مشخصی در دستگاه حمام آب فراصوت قرار داده شود که این زمان عموما بین 20-30 دقیقه میباشد.
نکته: قرار دادن محلول نانوذرات به مدت مناسب در دستگاه حمام آب فراصوت بسیار مهم است زیرا در صورت تصویربرداری از خوشه های نانوذرات، اندازه PSF بیش از حد تخمین زده می شود و در نتیجه رزولوشن میکروسکوپ کمتر از مقدار حقیقی آن اندازه گیری می شود.
3- در یک conical tupe به حجم 15 میلیلیتر، میزان 100 میکرولیتر از نانوذرات تحت فراصوت قرار گرفته باید با 9 میلیلیتر آب مقطر و 900 میکرولیتر اتانول 70% رقیق شود.
4- لام های میکروسکوپ باید با اتانول 70% شسته شود و با Kimwipe خشک شود.
نکته: برای این مرحله و بقیه مراحل آماده سازی لام به منظور جلوگیری از برخورد هر گونه چربی از اثر انگشت با سطح شیشهای لام و تاثیر بالقوه بر کیفیت تصویر، لازم است از دستکش های لاتکس یا نیتریل استفاده شود.
5- برای تمیز کردن لامل17/0 میلیمتری باید آن را در یک ظرف حاوی اتانول 70% به طوری که تمام سطح لامل به اتانول آغشته شود، فروبرد و سپس با یک پنس نوک تیز آن را از داخل ظرف خارج کرد و روی مشعل چراغ بنزنی قرار داد تا هم سطح لامل کاملا خشک و عاری از هر گونه گرد و خاک و اثر چربی شود و هم باعث ایجاد یک سطح آبدوست بر روی شیشه به منظور گسترش قطرات محلول نانوذره و توزیع یکنواخت نانوذرات روی سطح شیشه شود.
نکته: می توان برای تمیز کردن لامل به جای اتانول 70% از آب مقطر پزشکی و برای خشک کردن آن از دستگاه گاز نیتروژن و برای آبدوست کردن آن از دستگاه پلاسما استفاده کرد.
6- محلول نهایی نانوذرات باید بلافاصله قبل از مصرف به صورت دورانی تکان داده شود تا اطمینان حاصل شود که ذرات به صورت یکنواخت معلق هستند و سپس به مقدار 10-20 میکرولیتر از آن به صورت مستقیم بر روی لامل ریخته شود.
نکته: محلول نانوذرات باید به طور مستقیم روی لامل قرار بگیرند تا هنگام تصویر برداری تا حد ممکن به لنز شیئ نزدیک باشند و اگر نانوذرات روی لام میکروسکوپ قرار بگیرند ابیراهی کروی بالا خواهد بود و در این صورت نور برای رسیدن به نانوذرات باید از محیط نصب عبور کند.
7- لامل های آغشته به محلول نانوذرات را در ظرفی در بسته و درمحیطی تاریک و عاری از هر گونه گرد و غبار به مدت چند ساعت قرار دهید تا خشک شوند.
نکته: بهتر است لامل آغشته به محلول برای مدت یک شبانه روز در محیطی تاریک قرار بگیرد تا کاملا خشک شود.
8- برای کمک به یافتن نانوذرات در زیر میکروسکوپ می توان از یک مارکر برای کشیدن دایره در اطراف نمونه خشک شده در سمتی از لامل که نمونه وجود ندارد استفاده کرد.
9- یک قطره 15 میکرولیتری از محیط نصب ProLong Gold یا یک محیط نصب مناسب دیگر باید روی لام تمیز شده میکروسکوپ قرار داده شود.
نکته: برای اندازه گیری بهینه PSF ضریب شکست محیط نصب باید تا حد ممکن نزدیک به ضریب شکست شیشه ی لامل باشد.
ساده ترین محیط نصب استفاده از گلیسیرین 50% است.
10- لامل آغشته به محلول باید با دستکش و با پنس نوک تیز برداشته شود و در زاویه 45 درجه نسبت به قائم بر روی لامی که دارای قطره ای از محیط نصب است رها شود تا لامل و لام به درستی بر روی هم قرار گیرند.
11-وسط لامل را به آرامی با یک گوشپاک کن تمیز فشار دهید تا هر حباب هوایی که در محیط نصب وجود دارد به آرامی به لبه های لامل برود.
12-نمونه ها باید یک شب در مکانی تاریک و عاری از گرد و غبار قرار گیرند تا محیط نصب روی آن اثر کند.
13-نمونه ها باید از نظر تراکم صحیح نانوذرات بررسی شوند، به طوری که نانوذرات کافی بر روی لامل قرار گرفته باشد و خوشه بندی قابل توجهی در روی لامل مشاهده نشود.
14- اگر برای محیط نصب از ProLong Gold یا Cytoseal استفاده شود، می توان با نگهداری نمونه ها در دمای 4 درجه سانتی گراد آن ها را برای ماه ها نگهداری کرد.